Las imágenes que proporcionan los microscopios han maravillado visualmente a los científicos desde su invención, ya que con éstos se supera la limitante visual del ojo humano. Es muy probable que este mismo asombro surgiera en la primera observación de bacterias, cuando Athanasius Kircher en 1659 las describió como unos “gusanillos” presentes en la sangre de personas infectadas con peste babuina (Ledermann, 2012). Los ensayos pioneros de microscopia abrieron las puertas del universo microscópico provocando el surgimiento de nuevas áreas de estudio como la microbiología.
La tecnología de los microscopios ha evolucionado, en la actualidad es posible realizar la observación de biomoléculas y átomos. Un avance significativo fue la invención del microscopio electrónico (ME) por Ernst Ruska a principios del siglo XX, ya que este tipo de microscopios pueden alcanzar una resolución de hasta 0.1 nm (Bozzola y Russell, 1999).
Pero, ¿Qué impacto tiene el ME en la observación de bacterias? gracias al poder de resolución de los ME, es posible observar a detalle la ultraestructura de estos microorganismos, lo que facilita su identificación y caracterización, además de ser un soporte en el diagnóstico de enfermedades infecciosas (Jurado y Petruccelli, 2004).
Una de las técnicas de procesamiento de microscopia electrónica para observar bacterias es la tinción negativa, que se distingue por ser rápida y relativamente sencilla, una vez que se tienen estandarizadas las condiciones de ensayo. También, se puede usar tinción negativa para visualizar virus, organelos celulares y proteínas. El principio de la técnica mencionada consiste en usar soluciones de metales pesados que rodean los detalles estructurales de interés (“coloreándolos”), permitiendo un contraste con el fondo (Harris, 2007; Jurado y Petruccelli, 2004; Woo et al., 2010).
Al leer acerca de esta técnica da una impresión inicial de ser fácil de realizar y de obtener excelentes resultados. Sin embargo, existen distintos parámetros que deben analizarse y ajustarse dependiendo de la muestra a tratar. Los distintos reactivos, por su naturaleza química, interactúan de manera diferente con la muestra y con el medio en donde se encuentra, por lo que elegirlos es un punto clave para el éxito de la tinción.
Antes que nada, es pertinente hacer una profunda revisión bibliográfica acerca de ensayos realizados con esta técnica para un organismo en específico y de ser posible, probar los distintos tratamientos para elegir cuál de éstos nos proporciona los mejores resultados. El tipo de contrastante (metal pesado), el buffer (concentración y pH), el número de lavados, así como el tiempo que debe transcurrir en cada paso, son elementos cruciales en la tinción negativa y deben ser determinados experimentalmente para cada caso.
Una experiencia que se tuvo en el Área de Microscopia Electrónica del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (AME-CNRF) fue aplicar la técnica de tinción negativa para observar bacterias de importancia agrícola en el ME. A pesar de que existen metodologías descritas en la literatura científica, lo cierto es que al realizar los experimentos, los resultados no siempre son los esperados.
Los principales problemas que se enfrentaron al trabajar con bacterias fueron: la falta de contraste que impedía su observación; y el deterioro de estructuras como desprendimiento de flagelos (apéndices filamentos que sirven para impulsar el movimiento de organismos unicelulares).
Se realizaron diversos ensayos para cada una de las cepas bacterianas y se llegó a una conclusión: cada organismo tiene requerimientos distintos; y es sumamente importante realizar una búsqueda bibliográfica y analizar detenidamente los resultados previos obtenidos por otros grupos de investigación, con el fin de encontrar una respuesta a los retos que surgen al aplicar esta técnica.